PCR理论温度与实际温度为何存在差异？

关于PCR

PCR技术作为现代分子生物学技术的基础，经历多年的发展，从普通的PCR扩增，到荧光定量PCR，再到数字PCR，在理论及应用上已经有非常丰富的结果。但在实际操作中，一个依据理论计算可行PCR实验并不一定能在实际实验中复刻，可能原因多种多样，今天我们讨论PCR实验中设备对实验的影响。

我们先假设所有与试剂相关的因素均符合要求，类似酶活性、温度设置、反应时间、引物、反应体系等各种与设备无关的条件均是优化良好后，单纯讨论PCR设备所提供的温度环境及影响因素。

PCR设备一般存在两种控温模式，分别为模块控温及试管控温。模块控温即温度程序所表示的温度即为设备提供的金属模块的温度；试管控温即温度程序表示的温度为试管内反应液的温度。在整个过程中，设备都在往最靠近PCR温度程序的方向迈进，但以下几个问题的存在导致PCR的过程无法保证程序温度与试管内液体的温度保持一致。

1、PCR管的不一致

虽然PCR管的标准是一致的，但是标准本身存在一定的容差；此外，不同厂家的出厂标准判定不完全一致，产品的稳定性也存在差异，设备无法保证同样的控温策略在不同厂家的耗材上达成一样的结果；对于某些质量控制不佳的厂商，不同批次产品的结果都可能存在较大差异。

2、温控模块与PCR管不匹配

由于PCR管本身存在差异，叠合加热模块本身的差异，PCR管与模块无法完好贴合，最终导致PCR管内液体无法按照仪器的预设参数完成温度变化。

3、设备用料和结构设计

此项针对的是PCR仪的核心参数温度均匀性和变温速率，用料和结构设计决定了温度均匀性，同时也决定了变温速率的上限。普通PCR仪一般配置一块半导体制冷器，整板只能设置一个温度，有些梯度PCR仪也使用一块半导体制冷器，这样的梯度PCR仪基本无法保证设置的梯度温度和实际相符，理论上如果每个孔都配置单独的制冷器和温控探头，这样基本可以保证每孔的温度最接近预设温度，但是这样做的成本会升高。

4、仪器温控算法

算法的作用是控制温度的变化，防止温度过冲过度，同时进行根据探头反馈的温度信息实时进行温度策略的调节，帮助实现温度的准确度及更好的升温速率。

5、温度漂移

在经过长时间的使用后，仪器的测温探头准确性会逐渐降低，算法依据探头给的错误数据进行温控调整，最后表现为预设温度与实际温度差异大，而PCR对温度的准确性和均匀性要求高，所以解决方法只能是定期对仪器温度进行校准，确保仪器的处于良好的工作状态。

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